Острые кишечные инфекции (ОКИ) традиционно являются одной из актуальных проблем ветеринарии и здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, ежегодно регистрируется 1-1,2 миллиарда диарейных заболеваний, умирает до 4 миллионов человек, причем 60-70% заболевших составляют дети до 14 лет. В России общая заболеваемость ОКИ традиционно остается на высоком уровне и кишечные инфекции устойчиво занимают 3-4 место среди всех инфекционных заболеваний детей. Острые кишечные инфекции, по терминологии ВОЗ «диарейные болезни», — это группа инфекционных заболеваний, клинически характеризующихся острым диарейным синдромом. В настоящее время по родовому признаку различают более 30 нозологических форм ОКИ, вызываемых бактериями, простейшими и вирусами.
Вирусы, являющиеся этиологическими агентами острых кишечных заболеваний — это многочисленная группа вирусов, относящиеся как минимум к 9 семействам вирусов (таблица). В таблице представлены вирусы, вызывающие диарею у человека и животных. Не все вирусы гастроэнтерита животных патогенны для человека. Так, роль парвовирусов, широко циркулирующих среди собак, в инфекционной кишечной патологии детей до сих пор не доказана. Неясна ситуация с пикобирнавирусами, которые ассоциированы с диареей только у ВИЧ-инфицированных. Пестивирусы, являющиеся ведущим патогеном телят, от людей не выделены.
Основными этиологическими агентами вирусных диарей являются ротавирусы, аденовирусы, калицивирусы и коронавирусы. Среди них первое место в инфекционной кишечной патологии принадлежит ротавирусам.
Ротавирусы (RV, PB)
Ротавирусы (Reoviridae) являются основным этиологическим агентом острого инфекционного гастроэнтерита у детей, молодняка животных и птиц. Вызывает африканскую чуму лошадей. Как причина диареи у мышат РВ были идентифицированы в 1950 г., у обезьян и телят — в 1960 г., у детей — в 1973 г. австралийской исследовательницей Бишоп. В отдельный род Rotavirus РВ выделены на IV Международном конгрессе вирусологов в 1978 г.
Характеристика вируса
Ротавирион — двукапсидная, не содержащая липопротеиновой оболочки вирусная частица, размером 76,5 н.м., организованная согласно принципам икосаэдральной симметрии (Т = 13). Под электронным микроскопом ротавирион напоминает колесо с короткими спицами и хорошо различимым ободом, что послужило основанием названия вируса («rota» — колесо). В препаратах РВ, выделенных от больных животных и человека, под электронным микроскопом при негативном контрастировании можно наблюдать три типа частиц — гладкие двукапсидные (76,5 н.м.), шероховатые однокапсидные (70 н.м.) и сердцевины (50 н.м.), что отражает существование трех структурных элементов вириона — наружного и внутреннего капсидов и сердцевины.
Наружный капсид ротавириона представляет собой сотоподобную решетку толщиной около 10 нм, образованную гликопротеином VP7. На поверхности решетки расположено 60 выступов длиной 4,0 н.м. с утолщенным дистальным концом (димеры протеазочувствительного VP4). Поверхность пронизана 132 каналами трех типов, различающихся размерами и расположением. Они проникают сквозь оба капсида, достигая сердцевины. Внутренний капсид ротавириона имеет толщину 15-20 н.м., построен по принципу скошенного икосаэдра с Т = 13. Он состоит из 780 структурных единиц, организованных в 260 тримеров и состоящих из молекул единственного белка VP6. Сердцевина ротавирусной частицы (core) имеет гексагональную форму, характеризующуюся осями симметрии 2-го, 3-го и 5-го порядков. Оболочка core, имеющая толщину 0,15 нм, образована основным белком кора — VP2, ассоциированным с РНК-полимеразой (VP1) и гуанилтрансферазой (VP3), и пронизана маленькими порами вдоль 5-ти и 3-х кратных осей симметрии. Поры сердцевины соединены с каналами внутреннего капсида.
Геном ротавируса состоит из 11-ти сегментов двухнитевой РНК размером от 667 до 3302 п.н., суммарный размер составляет 18 556 п.н. Десять сегментов ротавирусного генома являются моноцистронными матрицами. Каждая предназначена для синтеза только одного белка. В то же время, ген VP7 является бицистронным и кодирует 2 гликопротеина, синтезирующихся с первого и второго инициирующих кодонов в одной рамке считывания.
Наличие на 5'-конце кэп-структуры, состоящей из метилгуанидина, свидетельствует, что плюс-нить РНК выполняет роль мРНК для синтеза вирусных белков, однако 3'-конец таких РНК не содержит поли-A последовательности. Семь концевых нуклеотидов консервативной последовательности 3'-конца ротавирусных генов выполняют роль минимального промотора при синтезе минус-нитей РНК.
При электрофорезе в ПААГ одиннадцать сегментов ротавирусного генома распределяются с образованием характерного профиля, состоящего их четырех классов генов (схема). Распределение сегментов внутри классов определяет электрофоретип ротавируса, который является стабильным признаком штамма и эпидемиологическим маркером.
Картирование генома ротавирусов группы А
Репродукция ротавирусов
Ротавирусная инфекция начинается прикреплением двухкапсидной вирусной частицы к специфическому клеточному рецептору, находящемуся на клетках цилиндрического эпителия, покрывающего вершины ворсинок слизистой оболочки тонкого кишечника. Рецепторами ротавирусов на поверхности энтероцитов являются мембранные белки, относящиеся к суперсемейству интегринов и состоящие из двух полипептидных цепей (α2β1 и α4β1 интегрины). Лигандами рецепторов являются белки VP7 и VP4. После адсорбции вируса на клеточной поверхности происходит его проникновение в клетку, которое происходит с использованием механизма рецепторного эндоцитоза. Для запуска инфекционного процесса необходимо сочетание проникновения вириона с его «раздеванием», которое напрямую зависит от протеолитической активации VP4. Центральный консервативный регион полипептидной цепи VP4 имеет участок, расщепляемый трипсином. При обработке трипсином VP4 нарезается на два пептида — VP5 и VP8. В результате расщепления происходит образование свободного NH -конца на полипептиде VP5, что приводит к активации инфекционности вируса. Существенным моментом в эффективном «раздевании» ротавириона является также низкая концентрация Ca во внутриклеточной среде, определяющая выход кальция из рецептосомы. Снижение концентрации кальция в рецептосоме приводит к дезинтеграции наружного капсида ротавириона, белки которого, в частности VP4, дезинтегрируют мембрану рецептосомы, в цитоплазму выходит однокапсидная вирусная частица.
Потеря ротавирионом наружного капсида приводит к активации РНК-зависимой РНК-полимеразы (VP1). Транскрипционная функция этого фермента направлена на синтез плюс-нитей РНК, являющихся как мРНК для синтеза вирус-специфических белков, так и матрицей для синтеза минус-нитей при сборке ротавирионов. Для проявления транскриптазной активности РНК-полимеразе необходимо присутствие VP6, который конформационно стабилизирует РНК-полимеразный комплекс. Вследствие этого, наработка плюс-нитей идет только в составе однокапсидной вирусной частицы по консервативному механизму без вытеснения цепи. Синтезированные мРНК кэпируются внутри частицы и покидают ее через поры однокапсидной частицы.
Большинство структурных и неструктурных белков ротавируса синтезируется на свободных рибосомах цитоплазмы. Только гликопротеины VP7 и NSP4 синтезируются на рибосомах, ассоциированных с мембраной ЭПР.
Предложена модель морфогенеза однокапсидной вирусной частицы. В инфицированных клетках существует три типа субвирусных частиц, обладающих репликазной активностью - прекор (45 н.м.), кор (65 н.м.) и однокапсидный вирион (75 н.м.). Прекор образуется в вироплазме как результат геномного группирования 11-ти плюс-нитей РНК и белков VP1, VP3, а также четырех NS белков. После ассоциации этих компонентов вирусная репликаза (VP1) инициирует синтез минус-нитей РНК на матрице мРНК. Когда минус-нити подвергаются удлинению, прекор конкурентно подвергается морфогенезу в кор путем добавления VP2. В основе образования коровой частицы лежит явление самосборки, что подтверждается способностью VP2 в условиях in vitro образовывать сферические, вытянутые и спиралевидные структуры.
Двигаясь к периферии вироплазмы, коровая частица приобретает VP6. VP2 содержит остаток миристиновой кислоты, которая связывается с N-концевым глицином в молекуле VP6. Известно, что VP6 способен образовывать, как в клетке, так и в условиях in vitro, гексагональные решетки и тубулярные структуры, что свидетельствует о роли белок-белковых взаимодействий и явления самосборки и в процессе формирования внутреннего капсида.
Субвирусная репликазная частица, состоящая из структурных белков, входящих в состав однокапсидного вириона и неструктурных белков, необходимых для репликации генома, имеет размер 100 н.м. В составе такой частицы продолжается удлинение минус-нитей РНК, при этом (+)РНК, выступающая из репликазной частицы, затягивается внутрь. Снижение количества выступающих из репликазных частиц нитей коррелирует по времени с уменьшением размера частиц, которое, по мнению авторов модели, может быть связано как с окончанием образования полноразмерных сегментов генома и их упаковкой внутри частицы, так и с потерей неструктурных белков, выполнивших свои функции.
Следующим этапом в морфогенезе ротавириона является почкование однокапсидной вирусной частицы через мембрану ЭПР, в процессе которого субвирусная частица приобретает временную псевдооболочку. Этот процесс является уникальной особенностью морфогенеза ротавирусов, отличающей их от других членов семейства Reoviridae. Рецептором однокапсидного ротавириона на цитоплазматической стороне ЭПР является C-конец полипептидной цепи трансмембранного гликопротеида NSP4, который присутствует в ЭПР в форме тетрамера. После транслокации однокапсидной частицы в просвет каналов ЭПР она теряет псевдооболочку, быстро замещающуюся белками наружного капсида. Белки VP4 и VP7 появляются в зрелой двукапсидной частице в течение 10-15 минут после почкования. Механизм транслокации VP4 с цитоплазматической стороны ЭПР в каналы ретикулюма остается неясным. Процесс связывания VP4 и VP7 при сборке наружного капсида носит спонтанный характер, о чем свидетельствует способность этих белков ассоциировать в условиях in vitro в присутствии Ca2+.
Инфекционный цикл заканчивается освобождением полных двукапсидных вирусных частиц, происходящим в результате клеточного лизиса уже через шесть часов после инфицирования клетки и достигающим максимума через 15-24 часа. Собственно процесс сборки ротавириона занимает по времени менее часа. Гибель клеток является следствием накопления вирусных токсинов, но не связана с образованием инфекционных вирусных частиц. При освобождении вирионов из клеток слизистой кишечника происходит протеолитическое расщепление VP4, и ротавирионы, попадающие в окружающую среду, не имеют целого VP4.
Антигенные свойства ротавирусов
Род Rotavirus объединяет 7 антигенных групп вирусов (A, B, C, D, E, F, G). К ротавирусам человека относятся вирусы, принадлежащие группе A (типичные ротавирусы), а также группам B и C (параротавирусы). Серологически группы различают по антигенам, локализованным на протеине VP6 (групповые антигены). Внутри групп по серологическим свойствам различают подгруппы и серотипы.
Наиболее эпидемически значимыми являются ротавирусы группы A, которые выделены от человека и молодняка животных. Ротавирусы группы B являются зооантропонозными возбудителями и вызывают заболевания у людей (эндемичны для Китая) и животных. Резервуаром возбудителя являются крысы. Ротавирусы группы C поражают людей, но преимущественно выделяются от свиней с диареями. Ротавирусы групп D и F — возбудители диарей у птиц.
98% ротавирусных диарей у детей вызывается ротавирусами антигенной группы A. Эти ротавирусы характеризуются широким антигенным разнообразием. По наличию подгрупповых антигенных детерминант, локализованных на VP6, различают две подгруппы ротавирусов — SI и SII. По серотиповым детерминантам, локализованным на гликопротеине VP7 (G-серотип ротавируса), выделено 9 серотипов ротавируса. Доминирующими являются G1-4 серотипы. Серотиповые свойства ротавирусов группы A определяются, кроме того, детерминантами, локализованными на протеазочувствительном VP4. Выделено 5 P-серотипов ротавируса. В настоящее время дифференциацию ротавирусов по VP4 проводят с использованием ПЦР. Доминирующими являются P4, P6, P8 генотипы вируса. Гены VP7 и VP4 существуют независимо, в связи с чем природные штаммы ротавирусов описываются как G/P варианты.
Ротавирусная инфекция
Ротавирусная инфекция (РВИ) — широко распространенное высококонтагиозное острое кишечное заболевание, нередко протекающее в тяжелой форме. В Российской Федерации заболеваемость населения ротавирусной инфекцией занимает 8-е ранговое место в структуре острых кишечных инфекций, а среди детей до 3-х лет в период сезонного подъема инфекции ротавирусы вызывают 60-90% острых кишечных инфекций неясной этиологии.
Клиническая картина РВИ мало отличается от кишечных инфекций другой этиологии и проявляется диареей, лихорадкой, рвотой и симптомами острого респираторного заболевания. В тяжелых случаях диарея и рвота приводят к обезвоживанию организма (эксикоз), что может явиться причиной смерти. У новорожденных детей РВИ протекает атипично, часто наблюдаются перфорации стенки кишечника. Ведущим синдромом при РВИ является гастроэнтерит, в связи с чем заболевание часто называют ротавирусным гастроэнтеритом (РВГЭ).
Ротавирусы поражают население разных возрастных групп, однако преимущественно болеют дети в возрасте до 3-х лет и пожилые люди в возрасте после 60 лет. Взрослые, как правило, являются бессимптомными вирусоносителями.
В странах северных широт с умеренным климатом РВИ чаще наблюдается в холодное время года, т. е. характеризуется выраженной осеннее-зимнее-весенней сезонностью проявлений. В летние месяцы ротавирусы выявляются у больных с диареями в единичных случаях.
РВИ характеризуется фекально-оральным механизмом передачи, который реализуется различными путями — водным, пищевым, бытовым, пылевым. Ротавирусы способны инфицировать клетки слизистых респираторного тракта и полноценно репродуцироваться в них, что создает условия для реализации аспирационного механизма передачи инфекции.
-конца на полипептиде VP5, что приводит к активации инфекционности вируса. Существенным моментом в эффективном «раздевании» ротавириона является также низкая концентрация Ca
во внутриклеточной среде, определяющая выход кальция из рецептосомы. Снижение концентрации кальция в рецептосоме приводит к дезинтеграции наружного капсида ротавириона, белки которого, в частности VP4, дезинтегрируют мембрану рецептосомы, в цитоплазму выходит однокапсидная вирусная частица.