Инициация синтеза цепи ДНК может происходить только при наличии затравки для ДНК-полимеразы. Вид затравки и способ ее образования различаются у разных вирусов и определяют своеобразие вирусных репликативных систем. Различают три основных способа инициации синтеза ДНК:
Инициация на внутренних участках ДНК — характерна для кольцевых матриц. Затравкой служит олигорибонуклеотид, который может быть синтезирован ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой. Эти ферменты могут иметь клеточное происхождение, или быть вирус-специфическими. Синтезироваться может одна затравка или несколько затравок.
На однонитевой матрице затравка синтезируется на определенном участке, узнаваемом ферментом. Двухнитевая матрица сначала подготавливается к инициации. На участке ori происходит присоединение хеликазы. Этот фермент расплетает участок матрицы, что приводит к образованию репликативной вилки с последующим синтезом затравки.
Инициация на концах ДНК (терминальная инициация) — характерна для линейных матриц. Различают две группы способов концевой инициации ДНК-синтеза: с использованием нуклеотидбелковой затравки и с использованием самозатравочного механизма.
Инициация синтеза с использовании разрывов и брешей — затравкой для дальнейшего удлинения цепи может быть 3'-ОН конец разорванной цепи ДНК.
Элонгация цепи при репликации вирусных геномов принципиально не отличается от процесса синтеза клеточных ДНК. Используются ферменты, вспомогательные белки и репликационные белки, принадлежащие как клетке хозяина, так и вирусу. Синтез ДНК, как правило, осуществляет ДНК-зависимая ДНК-полимераза II, в редких случаях — ДНК-полимераза III. Основным свойством синтеза является его полярность, при которой очередной нуклеотид присоединяется к 3'-концу растущей цепи. То есть направление синтеза идет от 5'- к 3'-концу, считывание - от 3'- к 5'-концу. Особенности синтеза комплементарных нитей связаны со способом инициации. На днДНК матрице синтез идет через образование репликативной вилки или с вытеснением цепи, на онДНК-матрице — по-репарационному механизму.
Стандартный механизм полуконсервативной репликации ДНК с образованием репликативной вилки включает следующие стадии:
1. Инициация репликации расплетением днДНК хеликазой. Репликация начинается не в случайной точке, а в специфическом месте, называемом точкой начала репликации (ori), которых может быть одна или несколько.
2. Синтез РНК-затравки ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой.
3. Синтез комплементарных цепей ДНК-полимеразой (II, III). Цепи ДНК синтезируются в результате присоединения дезоксинуклеотидов к 3'-концу растущей цепи, то есть в направлении от 5'- к 3'-концу вдоль матричной цепи. Синтеза цепей в обратном направлении не происходит. Поэтому синтезируемые цепи в репликативной вилке растут в противоположных направлениях. Синтез одной цепи происходит непрерывно — это ведущая, или лидирующая цепь. Синтез другой цепи идет импульсами — это отстающая цепь. Лидирующая цепь синтезируется в направлении роста репликативной вилки, отстающая — в обратном направлении в результате нескольких актов инициации. В итоге образуется несколько коротких цепей (фрагментов Оказаки), которые затем соединяются с образованием непрерывной отстающей цепи. Механизм репликации лидирующей и отстающей цепей в принципе одинаков и требует синтеза коротких РНК-затравок, комплементарных матричной цепи. Скорость копирования в репликативной вилке постоянна и равна 1,5 т.п.н./сек.
4. Дезинтеграция РНК-затравки РНКазой Н.
5. Сшивание фрагментов Оказаки ДНК-лигазой.
6. Снятие сверхспирализации топоизомеразами (топоизомераза I — вносит разрывы в одну цепь, топоизомераза II — вносит разрывы в обе цепи).
Терминация синтеза 1. Терминация синтеза и расхождение кольцевых геномов упрощены, поскольку синтез цепи идет по кругу и в конце полного оборота в точке ori или при двунаправленной репликации в середине кольца 3'- и 5'-концы вновь синтезированной цепи совмещаются и лигируются. Попарно сцепленные кольца разъединяются топоизомеразой.
2. В линейных ДНК, синтезированных с помощью РНК-затравок, все обстоит сложнее. Удаление РНК-праймера дает молекулу ДНК с выступающим 3'-концом и пробелом на 5'-конце. Предложено 2 способа завершения репликации с образованием полной копии матричной цепи (рис. 1).
Рис. 1. Схемы терминации синтеза линейных ДНК через образование конкатемеров (А) и через образование шпильки (Б)
В 1972 г. Уотсон предложил модель завершения репликации ДНК с прямыми повторами на концах через образование конкатемеров, которые представляют собой несколько тандемно-повторяющихся единиц генома. После образования конкатемера специфическая эндонуклеаза вносит ступенчатый разрыв в месте воссоединения. Это приводит к образованию выступающих 5'-концов и пробелов на 3'-конце, которые наращиваются ДНК-полимеразой. Бреши закрываются или путем репарации или лигирования.
Синтез полноразмерных линейных ДНК с инвертированными повторами на концах может быть завершен через образование шпильки. Инвертированные повторы — это две копии одной и той же последовательности ДНК в составе одной молекулы, находящиеся в противоположной ориентации. Прилежащие друг к другу инвертированные повторы образуют палиндромы. На рисунке 10 показано, что терминация 3'-конца через образование шпильки включает лигирование 3'-конца шпильки с 5'-концом комплементарной цепи, внесение одноцепочечного разрыва с образованием выступающего 3'-конца и его удлинение.
Основные схемы репликации ДНК-геномов
1. Репликация с использованием терминальной инициации при помощи самозатравочного механизма Такой тип репликации геномной ДНК имеют парвовирусы — самые мелкие (15-18 нм) икосаэдрические, безоболочечные, ядерные вирусы животных и насекомых. Геном представлен линейной онДНК, оба конца которой имеют самокомплементарные последовательности, формирующие шпилечные структуры. 3'-конец ДНК имеет уникальную последовательность размером 125 нуклеотидов, образующую двухнитевую Т-образную шпилечную структуру. Она выполняет роль затравки для ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза в результате репарационного синтеза комплементарной цепи воссоздает дуплекс, обе цепи которого на одном конце ковалентно соединены. При этом 3'-концевой сегмент родительского генома в качестве матрицы не используется. Следовательно, полного воспроизведения вирусного генома пока не произошло. На следующем этапе вирусоспецифический фермент вносит разрыв в родительскую цепь на границе между реплицированным и нереплицированным участками последовательности (между 125 и 126 нуклеотидами). Концевые 125 нуклеотидов родительского генома становятся условной частью вновь синтезированной цепи и возникший таким образом 3'-конец родительской цепи используется для ее регенерации. В результате этих реакций возникает дисперсная двухнитевая репликативная форма вирусной ДНК (рис. 2). Далее следует цепь реакций, включающих образование на одном из концов ДНК-затравки в виде «заячьих ушек», синтез новой цепи с вытеснением родительской, образование еще одной репликативной формы. Вторая репликативная форма ДНК используется в качестве матрицы для дальнейшего синтеза вирусной ДНК, а вытесненная из дуплекса однонитевая молекула или вступает в репликационный цикл, или входит в состав дочерней вирусной частицы.
Рис. 2. Схема первых этапов репликации генома парвовирусов. матричная нить; вновь синтезированная нить
2. Репликация с использованием терминальной инициации при помощи нуклеотид-белковой затравки Такой тип репликации геномной ДНК имеют аденовирусы — относительно крупные (до 90 нм) безоболочечные с икосаэдрическим типом симметрии капсида ядерные вирусы. Геном представлен линейной днДНК, имеющей на 5'-концах инвертированные повторы и ковалентно присоединенные геномные белки, имеющие молекулярную массу 55 кД (рис. 3).
В инфицированной аденовирусом клетке синтезируется вирусоспецифический белок массой 80 кД, который связывается через серии с дезоксицитидином. Образовавшаяся структура (80)Б—Ser—dCTP является затравкой, которая через цитозин связывается с 3'-концевым гуанозином генома и инициирует синтез цепи ДНК. Инициация может наблюдаться на любом конце родительской ДНК и может происходить или одновременно или последовательно. При последовательной инициации синтез дочерней цепи сопровождается вытеснением одной из родительских, а синтез комплементарной цепи идет на однонитевой матрице по репарационному механизму.
Рис. 3. Репликация ДНК аденовируса
Таким образом, каждая последующая двухнитевая молекула наследует одну родительскую цепь, то есть полуконсервативна. Однако процесс протекает без синтеза отстающей цепи, т.е. без образования множественных сайтов инициации и синтеза фрагментов Оказаки.
3. Репликация кольцевых геномов по механизму катящегося кольца Для реализации данного механизма репликации молекула нуклеиновой кислоты должна или исходно иметь, или воссоздать двухнитевую кольцевую структуру. Вновь созданная двухнитевая структура носит название репликативной формы (РФ). Воссоздание дн-структуры может протекать по-разному:
— кольцевые онДНК (фаги 174, М13) образуют репликативный дуплекс по стандартной схеме: синтез затравки — удлинение цепи — удаление затравки — достройка цепи — лигирование. Все ферменты, обеспечивающие перевод родительского генома в репликативную форму, имеют клеточное происхождение;
— линейная днДНК фага λ приобретает кольцевую форму за счет липких концов;
— ДНК герпесвирусов содержит прямые концевые повторы, у которых вирусспецифическая экзонуклеаза отщепляет однонитевые участки, после чего молекула приобретает кольцевую форму.
Репликация по механизму катящегося кольца в общих чертах имеет следующие стадии (рис. 4):
I. Вирус-специфический фермент вносит однонитевой разрыв в уникальном сайте родительской цепи репликативной формы.
II. Фермент остается связанным с 5'-концом, освободившийся 3'-концевой нуклеотид служит затравкой для ДНК-полимеразы.
III. ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды комплементарно замкнутой цепи, то есть синтезируется только лидирующая цепь. 5'-конец родительской цепи вытесняется. Наблюдается образование сигма-молекул (σ).
IV. После того, как репликационная вилка завершит чуть больше полного оборота, вытесненная цепь замыкается в кольцо, а фермент перемещается на вновь синтезированную нить и цикл повторяется.
Таким образом, вновь синтезированная нить, имеющая последовательность геномной, становится компонентом РФ, а предшествующая (родительская) оказывается в свободном виде.
Представленная классическая схема катящегося кольца часто является лишь промежуточной стадией репликации вирусных геномов. Например, при репликации генома фага λ реализуются несколько схем — схема Кернса, образование конкатемеров (см. ниже) и модифицированная схема катящегося кольца, которая наблюдается на поздней стадии репликации. В связи с этим, способ поздней репликации генома фага X называют способом вторичного разматывающегося рулона.
Рис. 4. Схема репликации ДНК по механизму катящегося кольца
4. Репликация ДНК по схеме Кернса Такой тип репликации хорошо изучен на примере обезьяньего вируса SV40, который входит в семейство полиомавирусов. Полиомавирусы — это относительно мелкие (45-55 нм) икосаэдрические безоболочечные ядерные вирусы, поражающие животных и человека. Геном — двухнитевая кольцевая сверхспирализованная ДНК, ассоциированная с клеточными гистонами.
Репликация протекает по следующей схеме (рис. 5):
1. Вирусоспецифический неструктурный белок (большой Т-антиген, обладающий хеликазной активностью) связывается с последовательностью размером 60 пар нуклеотидов (точка ori) и расплетает двухнитевую структуру.
2. Праймаза синтезирует две РНК-затравки. Образуются две репликативные вилки (2 лидирующие и 2 отстающие цепи), которые в процессе комплементарного синтеза удаляются друг от друга, двигаясь в разных направлениях. Наблюдается образование тета-молекул (θ).
Рис. 5. Репликация ДНК по схеме Кернса
3. Сбрасывание внутримолекулярного напряжения обеспечивает топоизомераза I путем внесения точечных однонитевых разрывов, которые тут же лигируются.
4. Образуются два дн-кольца, где родительские цепи соединены друг с другом. Разъединение осуществляет топоизомераза II, которая вносит двухнитевые разрывы.
5. Репликация ДНК с использование промежуточных конкатемерных форм Простейшая схема такой репликации наблюдается у бактериофагов T-нечетной серии, например T7. ДНК фага T7 — линейная двухнитевая молекула с прямыми концевыми повторами. Инициация репликации начинается на внутреннем участке, где расположен промотор для фаговой ДНК-зависимой РНК-полимеразы, которая синтезирует транскрипт, использующийся в качестве затравки для синтеза ДНК. Внутренняя инициация проходит без разрыва родительской цепи. Возникшие две репликативные вилки движутся в разных направлениях, осуществляя полуконсервативную репликацию вирусного генома. Первая стадия этого процесса заканчивается образованием двух дочерних дуплексов, где вновь синтезированные нити не достроены, так как не произошло копирования 3'-концов родительских цепей, что неизбежно возникает при внутренней инициации на линейной матрице. Таким образом, один из 3'-концов образовавшихся дуплексов находится в однонитевой форме.
Поскольку молекула ДНК фага Т7 имеет прямой концевой повтор, однонитевые 3'-концы сестринских молекул взаимно комплементарны и способны к ассоциации. Ассоциация комплементарных последовательностей приводит к образованию димерных молекул — конкатемеров. Далее созревание молекул идет аналогично рассмотренному нами выше способу терминации. Фагоспецифический фермент вносит в димер ступенчатый разрыв таким образом, что выступающими становятся 5'-концы, которые репарируются ДНК-полимеразой (рис. 6).
Рис. 6. Схема репликации ДНК фага T7
6. Репликация вирусных ДНК через интеграцию Интеграция — внедрение вирусной (или другой) последовательности ДНК в геном клетки хозяина, приводящее к ковалентному соединению с хозяйской последовательностью. В таком случае репликация вирусного генома и его транскрипция осуществляются по общим клеточным механизмам.
Интеграция вирусного генома в геном хозяина может происходить несколькими путями:
a) Интеграция с использованием сайт-специфической рекомбинации. В общем смысле рекомбинация — это взаимодействие между специфическими участками ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация — взаимодействие между специфическими парами последовательностей, в пределах которых имеются гомологичные последовательности. Это консервативная рекомбинация.
Например, при интеграции ДНК фага λ в рекомбинации участвуют два совершенно определенных участка вирусного и хозяйского геномов — attP и attB, соответственно. Эти участки имеют одинаковые сердцевины, но разные «плечи». Соответственно, фаговая последовательность обозначается как POP', клеточная — ВОВ'. В результате интеграции образуется участок ВОР'-----РОВ'.
Для осуществления интеграции необходима интеграза (топоизомераза I) и клеточный белок IHF (клеточный фактор интеграции). Интегрированный вирусный геном существует в виде профага и может выщепляться с участием вирусоспецифического белка.
b) Интеграция и репликация в процессе репликативной транспозиции. Транспозон — последовательность ДНК, способная реплицироваться и внедрять одну из копий в новое место генома.
Явление репликативной транспозиции установлено для транспозирующего фага Mu. Геном фага — линейная днДНК, размером 30 т.п.н., имеет на концах клеточные, а не вирусные нуклеотидные последовательности, то есть всегда находится в состоянии профага. После попадания вируса в клетку, ДНК приобретает форму, близкую кольцевой, сближая концы. Вирус-специфический белок вносит однонитевые разрывы как в клеточные последовательности фаговой ДНК, так и в ДНК клетки-хозяина. Разрывы могут происходить практически в любом месте ДНК. Выступающие 5'-концы клеточной ДНК ковалентно соединяются с 3'-концами вирусной ДНК. Лишние концы удаляются, бреши репарируются и фаговый геном оказывается встроенным в геном клетки хозяина. Особенностью репликации фага Mu является то, что она идет без выщепления профага. Копии ДНК, образуемые в процессе репликации, эффективно внедряются в новые места ДНК хозяина.
Последнее обновление страницы: 22 августа 2007 E-mail: vira-ss@narod.ru
матричная нить; 
вновь синтезированная нить
