Иммуноглобулины отличаются от других белков исключительным полиморфизмом. Полиморфизм проявляется в наличии разных изотопов, аллотипов иммуноглобулинов, а также в разнообразии активных центров антител (идиотипов), определяющих их специфичность по отношению к антигенным детерминантам.
Позвоночные в течение жизни способны создавать огромное количество вариантов антител, направленных против разных антигенов. Потенциальное разнообразие антител характеризуется цифрой, равной примерно 10¹. Геном позвоночных состоит из нескольких десятков тысяч генов. Так, в составе генома человека присутствует всего 23,5 тысячи генов. Если исходить из основной догмы молекулярной биологии «один ген — один белок», то этого количества генов совершенно недостаточно для того, чтобы обеспечить синтез колоссального числа различных иммуноглобулинов. Однако природа нашла поразительный выход из положения, использовав прием, который характерен только для лимфоцитов.
Во всех клетках, кроме созревающих В-лимфоцитов, кодирующая легкие и тяжелые цепи ДНК находится в так называемой «зародышевой конфигурации». Такую конфигурацию называют также генами зародышевой линии, или гаметными генами.
Тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов кодируются набором кодирующих нуклеотидных последовательностей, названных генными сегментами и разделенных друг от друга некодирующими участками ДНК. Генные сегменты являются предшественниками функционально активных генов и представляют собой экзоны, перемежающие с интронами. В ходе В-клеточного созревания эти генные сегменты перестраиваются и особым образом соединяются вместе, давая функционально активные гены цепей иммуноглобулинов.
У человека и мыши существует три группы генных сегментов, обеспечивающих синтез всего многообразия тяжелых цепей иммуноглобулинов: V (variable — вариабельный), D (diversity — обеспечивающий разнообразие) и J (joining — соединительный). 14-я хромосома человека содержит 51 VH-сегмент, 27 DH-сегментов и 6 JH-сегментов. Сегменты расположены последовательно группами от 5' к 3' концу. V-сегмент кодирует 95-96 аминокислотных остатков, D и J сегменты — 12-14 аминокислотных остатков. К 3'-концу примыкает серия C-генных сегментов, кодирующих константные домены (рис. 1).
Аналогичным образом выглядит зародышевая конфигурация ДНК, кодирующей легкие цепи. Так, ДНК, кодирующая каппа-цепи иммуноглобулина человека, состоит из примерно 40 Vκ-сегментов, пяти Jκ сегментов и одного C-генного сегмента. D-сегменты в ДНК, кодирующей легкие цепи, отсутствуют.
Зародышевая конфигурация ДНК обеспечивает колоссальное разнообразие активных центров иммуноглобулинов благодаря тому, что в созревающих В-лимфоцитах генные сегменты подвергаются перестройке. В ходе такой перестройки случайным образом объединяется по одному V, D и J сегменту (V и J сегменты для легких цепей). Каждый В-лимфоцит получает собственный набор объединенных сегментов. Природа в данном случае играет в биологический конструктор, добиваясь поразительных результатов.
Весь путь созревания В-лимфоцита от незрелой клетки-предшественницы до антителосекретирующей плазматической клетки можно разделить на несколько этапов.
1. Соматическая рекомбинация — перестройка (реаранжировка) генных сегментов, кодирующих вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Это первый этап на пути к синтезу антител и ключевой момент формирования функциональных вариабельных областей легких и тяжелых цепей. Соматическая рекомбинация идет на ранних этапах созревания В-лимфоцитов в костном мозге с участием специализированных ферментов. В результате соматической рекомбинации объединяются генные сегменты, кодирующие вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Объединенные экзоны, кодирующие V-домен, остаются при этом разделены интроном с генными сегментами, кодирующими константные домены. Соматической рекомбинации в ходе созревания В-лимфоцитов сначала подвергаются генные сегменты тяжелой цепи, затем - генные сегменты легких цепей.
Наличие множества генных сегментов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов, и их реаранжировка являются основной причиной полиморфизма активных центров антител. Дополнительным источником разнообразия формирующихся активных центров являются включение вставок между сегментами (так называемые P и N-вставки), вариации в соединении сегментов, приводящие к потере или появлению новых нуклеотидов и, соответственно, к сдвигу рамки считывания, комбинации V-доменов легких и тяжелых цепей при сборке полной молекулы иммуноглобулина и, наконец, соматические гипермутации, происходящие позднее в более зрелых В-клетках.
В перестроенных генах гипервариабельные участки V-доменов иммуноглобулинов кодируются последовательностями, находящимися на границе между сегментами. Гипервариабельность этих участков связана с тем, что дополнительные механизмы формирования разнообразия затрагивают именно эти районы нуклеотидной последовательности. Перестройка генов легких и тяжелых цепей происходит только в одной из двух гомологичных хромосом. Это обеспечивает аллельное исключение в отношении продуцируемых клеткой антител. В итоге одна В-клетка и ее потомство способны продуцировать только иммуноглобулины, имеющие идентичные активные центры.
Не каждая рекомбинация является продуктивной. Подсчитано, что в результате только одной из трех рекомбинаций формируется функционально активный ген. Если перестройка сегментов ДНК одной хромосомы является непродуктивной, то возможность перестроить генные сегменты получает вторая хромосома. Неудачные попытки перестройки генов приводят к смерти в костном мозге 90% созревающих клеток. Смерть происходит путем апоптоза. Существование отдельных генных сегментов, кодирующих V и С регионы иммуноглобулинов, и реаранжировку генов в процессе созревания В-клеток обнаружили в 1976 году Тонегава и Хозуми. За открытие механизмов формирования разнообразия антител Тонегава в 1987 году получил Нобелевскую премию.
2. Синтез цепей иммуноглобулинов. Перестроенный ген тяжелой цепи в созревающем В-лимфоците (про-B клетка) содержит объединенные V, D, J сегменты, соединенные на 3'-конце с генными сегментами, кодирующими константные домены иммуноглобулинов разных изотипов. Последовательность расположения таких сегментов от 3' к 5' концу ДНК выглядит следующим образом: μ, δ, γ, ε, α. Самым близким набором генных сегментов являются сегменты, кодирующие константные домены мю-цепи.
Первичный транскрипт РНК содержит нуклеотидные последовательности, включающие некодирующие интроны и генные сегменты, кодирующие домены иммуноглобулинов. Первичный транскрипт процессируется с удалением всех участков нуклеотидной последовательности кроме тех, которые кодируют вариабельный и константные домены мю-цепи.
Образовавшаяся матричная РНК транспортируется из ядра в цитоплазму, где происходит синтез мю-цепей на полирибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулюма. Мю-цепи после синтеза заякореваются на мембране эндоплазматического ретикулюма и объединяются с суррогатным полипептидом, заменяющим им легкую цепь. Затем происходит перестройка гена легкой цепи. На этой стадии В-лимфоцит представляет собой пре-B клетку.
Как тяжелые, так и легкие цепи подвергаются гликозилированию сначала в цистернах эндоплазматического ретикулюма, а затем в аппарате Гольджи, где одновременно происходит сортировка белков и перенос через систему везикул на поверхностную мембрану. Синтез легкой цепи приводит к появлению на мембране лимфоцита полноценного мембранного IgM и к переходу В-лимфоцита в стадию незрелой B-клетки.
Созревание в зрелую наивную B-клетку сопровождается одновременным появлением на клетке мембранного IgM и IgD. Они имеют один и тот же активный центр, но разные константные домены, образующиеся за счет альтернативного сплайсинга матричной РНК. Обе формы мембранного иммуноглобулина входят в состав В-клеточных рецепторов. В-лимфоцит, экспрессирующий (несущий на мембране) B-клеточный рецептор, выходит из костного мозга и приобретает способность активироваться при встрече с антигеном, взаимодействующим с активным центром иммуноглобулина.
3. Дополнительные модификации. Зрелые наивные В-клетки мигрируют в лимфоузлы и другие лимфоидные органы, где в результате встречи с антигеном происходит их активация. Активация приводит к трем дополнительным событиям, затрагивающим перестроенные гены иммуноглобулинов и характер их экспрессии:
— Переключение изотипа. Путем альтернативного сплайсинга матричной РНК генные сегменты, кодирующие мю-цепи и дельта-цепи, удаляются. На их место перемещаются сегменты, кодирующие константные домены тяжелых цепей других изотипов. В результате взамен иммуноглобулинов классов М и D В-клетки начинают синтезировать иммуноглобулины класса G, А или Е. Такие иммуноглобулины имеют тот же активный центр (вариабельный домен), но принадлежат к другому изотипу. Каждый В-лимфоцит в этом случае синтезирует иммуноглобулины только одного изотипа. Переключение изотипов регулируется цитокинами.
— Образование растворимых иммуноглобулинов (антител). Активация В-лимфоцитов приводит к их превращению в плазматические клетки — конечный этап дифференцировки В-клеток. Плазматические клетки теряют способность продуцировать мембранную форму иммуноглобулинов, но начинают синтез растворимых иммуноглобулинов. На 3'-конце каждой группы генных сегментов, кодирующих константные домены тяжелых цепей разных изотипов, имеются дополнительные кодирующие последовательности, определяющие принадлежность синтезируемого белкового продукта к растворимой или мембранной форме.
Если в результате альтернативного сплайсинга матричной РНК к сегменту, кодирующему последний константный домен, присоединяется дополнительный экзон, определяющий присоединение к С-концу белковой цепи группы гидрофильных аминокислот (S), то образуется растворимый иммуноглобулин. Если в этом участке остается экзон, кодирующий последовательность, состоящую из гидрофобных аминокислот (М), то образуется мембранная форма (рис. 2). Таким образом, антитела можно рассматривать как растворимую форму мембранных иммуноглобулинов.
— Соматические гипермутации. Затрагивают только гипервариабельные участки, кодирующие V-домены. Происходят в зародышевых (терминальных) центрах лимфоузлов, где концентрируются активированные В-клетки. Скорость соматических гипермутаций составляет 10 на одну пару нуклеотидов за одно клеточное деление. Нормальная скорость мутаций составляет 10-10 на пару нуклеотидов за одно клеточное деление. То есть скорость мутаций вариабельных участков в генах легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов на несколько порядков превышает нормальный темп мутаций. Одна мутация возникает в среднем за два клеточных деления. Клетки делятся каждые 6 часов. Механизм соматических гипермутаций остается неизвестным.
Рис. 2. Формирование мембранных и секретируемых иммуноглобулинов
Соматические гипермутации лежат в основе феномена аффинного созревания антител. В зародышевых центрах лимфоузлов происходит отбор и размножение В-лимфоцитов, продуцирующих иммуноглобулины с повышенной аффинностью, возникающей вследствие активного мутационного процесса.
. Геном позвоночных состоит из нескольких десятков тысяч генов. Так, в составе генома человека присутствует всего 23,5 тысячи генов. Если исходить из основной догмы молекулярной биологии «один ген — один белок», то этого количества генов совершенно недостаточно для того, чтобы обеспечить синтез колоссального числа различных иммуноглобулинов. Однако природа нашла поразительный выход из положения, использовав прием, который характерен только для лимфоцитов.
, ε, α. Самым близким набором генных сегментов являются сегменты, кодирующие константные домены мю-цепи.
на одну пару нуклеотидов за одно клеточное деление. Нормальная скорость мутаций составляет 10
-10
на пару нуклеотидов за одно клеточное деление. То есть скорость мутаций вариабельных участков в генах легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов на несколько порядков превышает нормальный темп мутаций. Одна мутация возникает в среднем за два клеточных деления. Клетки делятся каждые 6 часов. Механизм соматических гипермутаций остается неизвестным.
