Метод основан на поливалентности антител. За счет наличия нескольких активных центров в составе иммуноглобулинов они могут взаимодействовать с одинаковыми эпитопами на нескольких антигенах. В результате образуются видимые глазом и выпадающие в осадок агрегаты (преципитат). Если антиген содержит несколько эпитопов, то с ним связывается несколько антител, что увеличивает массу агрегата. Различают иммунопреципитацию в растворе и преципитацию в геле.
Иммунопреципитация в растворе является первым из разработанных методов иммунологического анализа и наименее чувствительным (рис. 1).
Существует количественный вариант иммунопреципитации в растворе, основанный на измерении мутности раствора с помощью нефелометрии.
Иммунопреципитация в геле позволяет определять антитела и антигены с более высокой чувствительностью, которая, однако, недостаточно высока по сравнению с современными методами иммунологического анализа. В качестве геля обычно используют тонкий слой агар-агара или агарозы. Антигены и антитела, нанесенные в лунки на некотором расстоянии друг от друга, диффундируют в толще геля. В месте их встречи образуется видимая глазом полоса (рис. 2).
Таким способом можно определить наличие или отсутствие в пробе антигена или антител. В первом случае в одну из лунок наносят антитела, направленные против искомого антигена. Во вторую — тестируемую пробу. Если образуется полоса преципитата, то в тестируемом образце имеется искомый антиген. При определении антител используют раствор антигена, к которому должны быть направлены искомые антитела. Метод может быть использован для определения веществ, находящихся в концентрации от 10 мкг/мл и выше. Ранее иммунопреципитация широко применялась в лабораторной практике, однако в настоящее время не используется в связи с относительно низкой чувствительностью.
Для методов, основанных на преципитации, важной является соотносительная концентрация взаимодействующих компонентов. Если концентрация одного из компонентов реакции намного превышает концентрацию второго, то преципитат может не выпадать вследствие быстрого истощения одного из компонентов и невозможности образования полноценного преципитата. Иммунопреципитация в геле может быть полуколичественным и количественным методом. В первом случае используют последовательные разведения тестируемых антител или антигенов. Последнее разведение, в котором антитела или антигены способны давать положительную реакцию, называют титром. При использовании разных иммунологических методов титры могут меняться. Это зависит от чувствительности метода, то есть минимальной концентрации, в которой выявляются тестируемый антиген или антитела.
Существует несколько усовершенствованных модификаций иммунопреципитации в геле:
Радиальная иммунодиффузия. В этом случае подготавливается плоский гель, в котором один из компонентов системы антиген-антитело размещен равномерно по всей толще геля. Второй компонент, тестируемый в системе антиген-антитело, помещают в лунку в центре плоского геля. Последующая диффузия тестируемого компонента приводит к образованию кольца преципитации вокруг центральной лунки. Чем выше концентрация тестируемого компонента, тем больше диаметр образующегося кольца. При использовании соответствующих калибровочных образцов, то есть набора проб с известной концентрацией, может быть проведено количественное определение компонента, наносимого в центральную лунку (рис. 3).
Иммуноэлектрофорез. Метод является качественным. С его помощью можно одновременно в одной пробе определить наличие множества антигенов, выявляемых антителами. Проводят электрофорез тестируемого образца в агарозном геле, затем по сторонам геля параллельно направлению миграции антигенов делают длинные лунки (траншеи), в которые заливают антисыворотку, содержащую антитела к тестируемым антигенам. При наличии в тестируемом образце искомых антигенов образуются дуги преципитации в тех зонах, куда мигрировали при электрофорезе антигены. Этим же методом можно определить наличие антител к конкретному антигену, находящемуся в смеси с другими антигенами (рис. 4).
Агглютинация (от лат. agglutinatio — склеивание). В основе метода лежит формирование видимых невооруженным глазом конгломератов клеток или частиц при образовании между ними молекулярных мостиков. В качестве мостиков могут выступать антитела и антигены. В основе феномена агглютинации лежит поливалентность антител, дающая возможность одному антителу связаться с несколькими клетками или частицами одновременно.
Агглютинация может происходить между бактериальными клетками, между клетками крови, в частности эритроцитами, между латексными частицами. Бактериальные клетки несут поверхностные антигены. При добавлении к бактериальным клеткам антител против таких антигенов будет происходить их агглютинация. Определение групп крови с помощью соответствующих антисывороток также основано на феномене агглютинации. В этом случае образование конгломератов клеток с последующим их осаждением происходит в том случае, когда эритроциты несут на своей поверхности антигены (изоагглютинины), взаимодействующие с добавляемой к ним антисывороткой. При агглютинации эритроцитов метод называют гемагглютинацией (рис. 5).
Эритроциты и соответствующие им по размерам латексные частицы могут быть химически сшиты с каким-либо антигеном или антителом. Добавление к ним второго компонента системы «антиген-антитело» будет приводить к агглютинации, сопровождающейся быстрым выпадением в осадок больших конгломератов клеток. Метод гемагглютинации и латексной агглютинации широко используется для качественного и количественного определения различных антигенов и антител. Разработано множество модификаций метода. Он более чувствителен, чем иммунопреципитация, и позволяет выявлять антигены в концентрации, равной 10-100 нг/мл и выше. Однако в настоящее время разработаны более чувствительные методы, которым отдается предпочтение.
Литература: Новиков В. В., Добротина Н. А., Бабаев А. А. Иммунология: Учебное пособие. Нижний Новгород: Изд-во ННГУ им. Н. И. Лобачевского, 2004. - 212 с.
Последнее обновление страницы: 23 марта 2007 E-mail: vira-ss@narod.ru
