Методы, основанные на использовании специфической метки
Иммунофлуоресценция. Метод основан на применении в качестве метки флуоресцирующих соединений. Метку химически пришивают к антителу или антигену. Это позволяет регистрировать реакцию антиген-антитело с помощью соответствующих приборов и увеличивает чувствительность анализа. Чаще всего с помощью иммунофлюоресценции определяют антигены на поверхности клеток. С этой целью тестируемые бактериальные или эукариотические клетки обрабатывают антителами, мечеными флуоресцентной меткой, а затем оценивают реакцию с помощью люминесцентного микроскопа (рис. 1).
Иммунофлуоресцентный метод широко используется для иммунофенотипирования клеток иммунной системы, то есть для определения набора антигенов, представленных на поверхности клетки. Как правило, с этой целью применяют наборы моноклональных антител, направленных против различных антигенов. Если используют меченые моноклональные антитела, то метод называют прямым. Если клетки обрабатывают немечеными моноклональными антителами, а затем флуоресцентно мечеными антителами, направленными против моноклональных антител, то метод называют непрямым. В этом случае моноклональные антитела называют первыми антителами, а меченые антитела против моноклональных антител вторыми антителами. Вторые антитела чаще всего являются антивидовыми, то есть направлены против иммуноглобулинов того или иного вида животных. Поскольку диагностические моноклональные антитела чаще всего являются мышиными, то используют поликлональные антитела против иммуноглобулинов мыши.
В качестве метки используют различные флуоресцирующие соединения. Наиболее распространенным является флуоресцинизотиоционат. Кроме люминесцентной микроскопии для иммунофенотипирования применяют также проточную лазерную цитофлуорометрию. Принцип метода основан на лазерном анализе флуоресценции каждой отдельной клетки, обработанной мечеными моноклинальными антителами.
С помощью иммунофлуоресценции определяют популяционный состав лимфоцитов периферической крови. Так, с помощью соответствующих моноклональных антител можно подсчитать количественное соотношение CD4-положительных и CD8-положительных Т-лимфоцитов, определив тем самым иммунорегуляторный индекс. Иммуноферментный метод. Объединяет возможности иммунологических и биохимических подходов. В качестве метки используются ферменты, химически сшитые с антигеном или антителом. Он шире других методов распространен в диагностической практике. Обладает высокой чувствительностью (десятые доли нанограмма на миллилитр), позволяет анализировать одновременно множество проб, может быть как качественным, так и количественным методом, легко стандартизуется, не требует большого количества времени.
Существует множество различных вариантов иммуноферментного метода. Чаще всего применяется твердофазный иммуноферментный анализ (рис. 2). Один из компонентов системы «антиген-антитело» сорбируется на твердую фазу, в качестве которой обычно используется полистирол, имеющий 96 лунок объемом 0,2 мл. В каждой лунке планшета проводится отдельная реакция, которая затем может быть отдельно проанализирована.
При анализе антигенов на стенке лунок полистиролового планшета сорбируются антитела против данного антигена, затем добавляется раствор тестируемого антигена и проводится инкубация, в ходе которой происходит взаимодействие «антиген-антитело». После отмывания не-связавшегося материала в лунки планшетов добавляют антитела против того же антигена, сшитые с ферментом. Формируется связанный с твердой фазой комплекс, состоящий из антител, антигена и антител, меченых ферментом. Комплекс напоминает бутерброд, в связи с чем такой вариант иммуноферментного анализа назван сэндвич-методом. Для повышения специфичности метода используют моноклональные антитела, направленные к разным эпитопам антигена.
Реакция «антиген-антитело» проявляется добавлением в отмытую лунку планшета субстрата для фермента. Используются такие субстраты, которые способны менять свою окраску в присутствии фермента. Чаще всего в качестве фермента используется пероксидаза хрена. Она расщепляет перекись водорода на воду и атомарный кислород. Последний окисляет бесцветные фенольные соединения, у которых появляется окраска. В настоящее время в этих целях применяют ортофенилендиамин (ОФД) и тетраметилбензидин (ТМБ). Появление окрашивания свидетельствует о связывании фермента с твердой фазой и, в данном случае, о положительной реакции на антиген. Количество антигена в растворе оценивается по интенсивности окрашивания раствора субстрата.
Существуют конкурентные и неконкурентные методы анализа. Сэндвич-метод является неконкурентным. В конкурентном варианте определения антигена взамен антител, сшитых с ферментом, одновременно с немеченым добавляется стандартизированный антиген, меченый ферментом. Он конкурирует с немеченым антигеном за связывание с сорбированными антителами. Чем выше концентрация тестируемого (немеченого) антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с твердой фазой. То есть в данном случае снижение интенсивности иммуноферментной реакции будет свидетельствовать о наличии антигена в тестируемом растворе.
Иммуноферментный анализ применяется для определения самых различных антигенов. С его помощью тестируют наличие в крови антител к самым разным возбудителям инфекций, определяют аутоантитела, оценивают содержание вирусных и бактериальных антигенов, белков крови, опухолевых антигенов, гормонов, наркотиков и многое другое. Метод применяется не только в биомедицине и научных исследованиях, но и в сельском хозяйстве, при экологическом мониторинге и так далее.
Радиоиммунный анализ. Обладает наибольшей чувствительностью. Способен выявлять пикограммовые концентрации антигена в миллилитре. Однако т связи с тем, что в качестве метки применяются изотопы, не нашел столь широкого применения, как иммуноферментный метод. Кроме того, выполнение радиоиммунного анализа требует специализированного оборудования и специальных условий, что также осложняет распространение этого метода. Чаще всего при проведении радиоиммунного анализа используют конкурентные методы. Радиоиммунологический анализ в медицине используется для определения кортикостероидных гормонов и некоторых других антигенов.
Литература: Новиков В. В., Добротина Н. А., Бабаев А. А. Иммунология: Учебное пособие. Нижний Новгород: Изд-во ННГУ им. Н. И. Лобачевского, 2004. - 212 с.
Последнее обновление страницы: 24 марта 2007 E-mail: vira-ss@narod.ru
